¿Qué tipo de HPLC es el que debo utilizar?

De acuerdo al tipo de objetivo cromatográfico, existen diferentes escalas de equipos de HPLC, cuyo funcionamiento es igual, pero ofrecen resultados diferentes según la cantidad de analito que se desee procesar.

Escala analítica, que define la información del compuesto (identificación y concentración)

Escala semi – preparativa, brinda información del compuesto y permite purificar pequeñas cantidades (inferior a 0.5g).

Escala preparativa, brinda información del compuesto y permite purificar cantidades mayores (superior a 0.5g).

Escala de proceso (industrial), maneja cantidades de manufactura (producción), de gramos hasta kilogramos de analito separado.

Para trabajar a estos niveles es necesario modificar algunas características del equipo de HPLC, entre ellas los volúmenes de solvente utilizado y tipo de material de empaque (selectividad del sistema). Pero, para soportar las cantidades específicas de cada método, es necesario tener una columna apta para cada escala, por lo cual se debe modificar el tipo de volumen de la columna (que implica cambiar de columna, ver tabla 1).

Para esto existen diferentes tipos de columnas, de diferentes diámetros, largos, materiales de empaque y tipo de material de construcción; capaces de resistir altas presiones y ser totalmente inerte a reaccionar con los componentes de la muestra. Entre estos se encuentran: los construidos en plástico, en vidrio  o en acero inoxidable.

Tabla 1. Escala cromatográfica vs diámetro de columna y tamaño de partícula.

Escala	Diámetro de la columna				Tamaño de partícula (micrones)
	1 – 8 mm	10 - 40 mm	50 – 100 mm	> 100 mm
Analítica	X				1.7 – 10
Semi-preparativa		X			5 - 15
Preparativa			X		15 – 100
Proceso				X	100 +

A partir de esto se desprenden varias definiciones acerca de la capacidad del equipo para separar los componentes de la muestra, a esto se le llama Resolución y la conforman dos habilidades: La separación mecánica (Eficiencia) y la separación química (Selectividad).

La Eficiencia del equipo depende principalmente de las características de la columna (diámetro, longitud y tamaño de partícula del material de empaque). Pero, la modificación de las características de la columna repercuten sobre el tiempo de corrida, la cantidad de solvente implicado y la presión necesaria para realizar el muestreo.

Por ejemplo: Una columna el doble de larga puede mejorar la separación de dos picos, pero duplicaría el tiempo de corrida y la presión necesaria para hacer fluir el solvente, también al doble.

Si por el contrario, se utiliza la misma columna inicial pero rellena con un tamaño de partícula dos (2) veces menor, es posible obtener picos en mejor resolución con el mismo tiempo de retención pero con un aumento en la presión hasta veinticinco (25) veces mayor.

Por otro lado, mejorar la Selectividad es el método más efectivo para lograr una mejor separación sin tener que modificar la columna o sus características. Esto se realiza mediante una correcta selección del solvente (puro o mezcla), con su respectivo gradiente; de modo que la interacción de la muestra, con la fase estacionaria y la fase móvil, sea selectiva para cada tipo de componentes, logrando la separación de la muestra.