Interacciones: Fase estacionaria – Fase móvil – Muestra.

Existen tres tipos de interacciones moleculares principales que rigen la cromatografía líquida, estos son: Polaridad, Carga eléctrica y Tamaño molecular.

La cromatografía basada en la polaridad de los compuestos es la más común, de la cuál sobre salen dos modos: la cromatografía de Fase normal y de Fase reversa.

La cromatografía basada en la polaridad tiene como teoría utilizar un solvente y un material de empaque que posean polaridades opuestas, ya que, de acuerdo a la polaridad, compuestos de polaridades similares se atraen y compuestos de polaridades opuestas se repelen. Es decir, de manera opuesta a la teoría electromagnética, donde los opuestos se atraen, en la polaridad lo similar atrae (disuelve) lo similar.

De acuerdo con esto, un solvente apolar (o no-polar) como el hexano arrastraría con mayor facilidad compuestos apolares en la muestra, como cadenas alifáticas o aromáticas. Por otro lado, un solvente polar como el agua o alcoholes, atraerán con mayor fuerza muestras polares, como ácidos o sales.

De igual forma, una fase estacionaria apolar, como el C₁₈ o C₈ , atraerá mayoritariamente compuestos apolares; y una Fase estacionaria polar, como la silica, atraerá mayoritariamente compuestos polares. La fase estacionaria Polar (silica) se le conoce como Fase Normal, debido a que fue la fase utilizada primeramente en los experimentos de Tswett; por otro lado, a la fase estacionaria apolar se le conoce como Fase reversa (o invertida).

Tabla 2. Características de la separación por polaridad.

Modo de separación	Fase estacionaria	Fase móvil
Fase normal	Polar	No – polar
Fase Reversa	No – polar	Polar

En este tipo de separación existen dos variables, la cromatografía con interacción hidrofílica (HILIC) y la cromatografía con interacción hidrofóbica (HIC).

En la técnica HILIC, basada en la cromatografía en fase normal, se utilizan cantidades pequeñas de agua (< 20%) en la fase móvil, de modo que sea posible arrastrar los compuestos que estén retenidos fuertemente a la fase estacionaria (Polar).

Por otro lado, la técnica HIC es un tipo de cromatografía de fase reversa, en la cual se utilizan fases estacionarias moderadamente hidrofóbicas (apolares), como la sílica unida a C₄, pero controlando el nivel de sales en la fase móvil polar. Este método es especial para compuestos biológicos, como proteínas, donde concentraciones altas de sal ayudan a retener la proteína en la fase estacionaria [salted out], sin des-naturalizarse; mientras que, a medida que se disminuye la concentración de las sales, las moléculas retenidas en la fase estacionaria comienzan a ser arrastradas por la fase móvil.

Las separaciones cromatográficas basadas en la carga eléctrica, llamadas cromatografía de intercambio iónico [IEC], tienen su base en utilizar fases móviles y estacionarias cargadas eléctricamente. Si la fase estacionaria está cargada positivamente [+], la técnica se llama intercambio Aniónico; si la fase estacionaria está cargada negativamente [-], la técnica se llama intercambio catiónico.

Esta técnica es un poco más compleja, ya que la liberación de los compuestos, a medida que se realiza el arrastre, tiene que ver con el control del pH de la fase móvil y el conocimiento previo del tipo de muestra analizada (ácido fuerte, ácido débil, base fuerte o base débil).

El último tipo de técnica utilizada es la cromatografía por exclusión de tamaño, la cual se realiza a través de una columna empacada con un polímero, cuya porosidad es muy uniforme y es aproximadamente conocida. Contrario a lo que podría pensarse, las moléculas más grandes son las primeras en salir de la columna, ya que no son retenidas entre las porosidades del polímero, de modo que es arrastrada más fácilmente por el solvente. Por otro lado, las moléculas más pequeñas son ocluidas dentro de los poros, y entran de un poro a otro, ocultándose del flujo del solvente. De este modo se cumple la regla: Los grandes salen primero.