Como inició la Cromatografía Líquida y la importancia de “Color”.

La cromatografía líquida es una técnica de análisis químico, en la cual se hace pasar una muestra solubilizada a través de un material granulado, mediante el flujo de un solvente. El objetivo de esto es separar la muestra en sus componentes individuales o separar algún componente en específico.

La técnica fue nombrada así inicialmente, cerca de 1900, por el botánico ruso Mikhail S. Tswett, quien durante sus investigaciones con extractos de pigmentos de hojas, hizo pasar una muestra de extracto a través de un tubo de vidrio rellena con tiza (carbonato de calcio) y alúmina. Tswett observó cómo su muestra se separaba en diferentes tipos de colores a medida que fluía el solvente por el tubo de vidrio, y relacionó esto con la separación de los componentes que inicialmente estaban en la muestra.

Tswett, cuyo nombre también significa Color, acuñó el nombre cromatografía de los vocablos griegos Chroma, que significa Color, y Graph, que significa escribir. 

El desarrollo de la cromatografía líquida y sus técnicas.

Existen dos (2) grupos en los cuales se separan las técnicas de cromatografía líquida de acuerdo a su modo de ejecución: Planas (o De Superficie) y de Columna.

Las técnicas Planas tienen como base el principio de capilaridad. Aquí la muestra se coloca como un punto sobre una placa, que puede ser de vidrio o plástica, inicialmente cubierta sobre la superficie con el material de partículas (fase estacionaria), o también puede ser de papel sin material de partículas. Acto seguido, la muestra es arrastrada por el solvente (fase móvil), el cual se distribuye sobre la placa por medio de capilaridad. Este arrastre puede ser lineal ascendente (Fig. 1) o Radial (Fig. 2), esta última puede realizarse sobre una placa de silica o de papel.

Figura 1. Cromatografía de capa fina. Flujo ascendente.

Figura 2. Cromatografía en papel, Flujo radial.

Las técnicas de Cromatografía de columna son más similares a los experimentos realizados por Tswett; en éste una muestra pasa a través de una columna o cartucho que contiene la fase estacionaria y el solvente fluye a través del dispositivo hasta una abertura al final del tubo, donde se recolecta el solvente, el cual contiene solubilizados algunos componentes de la muestra (Fig. 3). Este método se conoce como SPE, extracción en fase solida (por sus siglas en inglés, Solid – phase extraction).

Figura 3. Cromatografía de columna.

En cromatografía los compuestos se separan debido a la interacción ejercida con la fase estacionaria y la fase móvil; Aquellos compuestos que tienen mayor atracción a la fase móvil fluyen con mayor velocidad en la columna y salen primero; por otro lado, los compuestos que poseen mayor afinidad a la fase estacionaria serán retenidos más fuertemente y tomarán más tiempo en abandonar la columna.

Para mejorar la separación de una muestra puede utilizarse fases móviles con un tamaño de partícula inferior a 10 micrones, pero esto aumenta la resistencia de la muestra a fluir, lo cual implica utilizar presiones moderadas o altas, que permitan tener un flujo de solvente óptimo. A este tipo de cromatografía se le conoce como HPLC.

Características del HPLC.

 Las partes básicas que conforman un equipo de HPLC son: La fuente de solvente o reservorio, la bomba de presión (encargada de manejar el flujo del solvente), el inyector (por donde ingresa la muestra), la columna (llena de material de empaque), el detector (puede ser de varios tipo y es el encargado de “ver” la muestra al salir de la columna); a partir del detector hay dos salidas, una es la del desecho del solvente de paso y la otra es la que lleva la información a la estación de información (computador, Fig. 4).

Figura 4. Procesamiento de datos.

Al pasar a través del detector y enviar la información al computador, el sistema se encarga de ir mostrando la información de una manera interpretable; a esta información se le conoce como Cromatograma. Este expone una relación entre la concentración de la muestra con respecto a la línea base de señal de la fase móvil (la señal emitida por el solvente se asume como cero) y el tiempo transcurrido desde el momento de la inyección de la muestra y la salida de los compuestos de la columna cromatográfica.

A partir de la información proporcionada por el Cromatograma y de las variables usadas en el método (velocidad flujo, tipo de columna, etc) es posible llegar a identificar y cuantificar los componentes de una muestra, siempre y cuando se cuente con valores de referencia bajo las mismas condiciones.

El Cromatograma (Fig. 5) está conformado por una línea base que avanza con respecto al tiempo, y las señales de los compuestos, representadas como picos de intensidad y ancho variable, dependientes de las características del método y del compuesto. Un pico grande (mayor área bajo la curva) implica una mayor concentración; un pico pequeño (menor área bajo la curva) implica menor concentración. De igual forma, un pico ancho, se relaciona a mayor afinidad (atracción) con el material de la columna; un pico delgado y fino, se relaciona con una mayor afinidad con el solvente.

Figura 5. Cromatograma generado durante el procesamiento de información.

¿Isocrático o no isocrático?

Para mejorar el efecto de separación y lograr evidenciar señales más claras, para diferentes corridas de una misma muestra, asumiendo que se cuenta con una sola clase de columna cromatográfica, se pueden realizar gradientes en el solvente de elución.

Existen 2 formas básicas de utilizar el solvente: Isocrático, lo cual significa que el solvente conserva la misma concentración durante todo el tiempo de corrida (muestreo o análisis), sea que se trate de un solvente puro o de mezclas de solventes.

Por otro lado, está el sistema No-Isocrático, lo cual significa que la concentración del solvente utilizado varía durante la corrida. Esto depende del tipo de muestra, de columna y de la necesidad del análisis de mejorar alguna separación (depende del analista o investigador). La idea es que la fuerza de arrastre de la fase móvil aumente gradualmente durante la corrida, de modo que pueda desplazar a los compuestos que se encuentren más fuertemente retenidos en la fase estacionaria.

Existe dos tipos de sistemas para el mezclado de solventes: Alta presión y Baja presión. En el sistema de Alta presión, se poseen bombas individuales para cada solvente y el mezclado se realiza después de haber pasado las bombas, en un mezclador previo al inyector. En el sistema de baja presión se posee una válvula de mezclado previo a una única bomba de presión.

¿Qué tipo de HPLC es el que debo utilizar?

De acuerdo al tipo de objetivo cromatográfico, existen diferentes escalas de equipos de HPLC, cuyo funcionamiento es igual, pero ofrecen resultados diferentes según la cantidad de analito que se desee procesar.

Escala analítica, que define la información del compuesto (identificación y concentración)

Escala semi – preparativa, brinda información del compuesto y permite purificar pequeñas cantidades (inferior a 0.5g).

Escala preparativa, brinda información del compuesto y permite purificar cantidades mayores (superior a 0.5g).

Escala de proceso (industrial), maneja cantidades de manufactura (producción), de gramos hasta kilogramos de analito separado.

Para trabajar a estos niveles es necesario modificar algunas características del equipo de HPLC, entre ellas los volúmenes de solvente utilizado y tipo de material de empaque (selectividad del sistema). Pero, para soportar las cantidades específicas de cada método, es necesario tener una columna apta para cada escala, por lo cual se debe modificar el tipo de volumen de la columna (que implica cambiar de columna, ver tabla 1).

Para esto existen diferentes tipos de columnas, de diferentes diámetros, largos, materiales de empaque y tipo de material de construcción; capaces de resistir altas presiones y ser totalmente inerte a reaccionar con los componentes de la muestra. Entre estos se encuentran: los construidos en plástico, en vidrio  o en acero inoxidable.

Tabla 1. Escala cromatográfica vs diámetro de columna y tamaño de partícula.

Escala	Diámetro de la columna				Tamaño de partícula (micrones)
	1 – 8 mm	10 - 40 mm	50 – 100 mm	> 100 mm
Analítica	X				1.7 – 10
Semi-preparativa		X			5 - 15
Preparativa			X		15 – 100
Proceso				X	100 +

A partir de esto se desprenden varias definiciones acerca de la capacidad del equipo para separar los componentes de la muestra, a esto se le llama Resolución y la conforman dos habilidades: La separación mecánica (Eficiencia) y la separación química (Selectividad).

La Eficiencia del equipo depende principalmente de las características de la columna (diámetro, longitud y tamaño de partícula del material de empaque). Pero, la modificación de las características de la columna repercuten sobre el tiempo de corrida, la cantidad de solvente implicado y la presión necesaria para realizar el muestreo.

Por ejemplo: Una columna el doble de larga puede mejorar la separación de dos picos, pero duplicaría el tiempo de corrida y la presión necesaria para hacer fluir el solvente, también al doble.

Si por el contrario, se utiliza la misma columna inicial pero rellena con un tamaño de partícula dos (2) veces menor, es posible obtener picos en mejor resolución con el mismo tiempo de retención pero con un aumento en la presión hasta veinticinco (25) veces mayor.

Por otro lado, mejorar la Selectividad es el método más efectivo para lograr una mejor separación sin tener que modificar la columna o sus características. Esto se realiza mediante una correcta selección del solvente (puro o mezcla), con su respectivo gradiente; de modo que la interacción de la muestra, con la fase estacionaria y la fase móvil, sea selectiva para cada tipo de componentes, logrando la separación de la muestra.

Interacciones: Fase estacionaria – Fase móvil – Muestra.

Existen tres tipos de interacciones moleculares principales que rigen la cromatografía líquida, estos son: Polaridad, Carga eléctrica y Tamaño molecular.

La cromatografía basada en la polaridad de los compuestos es la más común, de la cuál sobre salen dos modos: la cromatografía de Fase normal y de Fase reversa.

La cromatografía basada en la polaridad tiene como teoría utilizar un solvente y un material de empaque que posean polaridades opuestas, ya que, de acuerdo a la polaridad, compuestos de polaridades similares se atraen y compuestos de polaridades opuestas se repelen. Es decir, de manera opuesta a la teoría electromagnética, donde los opuestos se atraen, en la polaridad lo similar atrae (disuelve) lo similar.

De acuerdo con esto, un solvente apolar (o no-polar) como el hexano arrastraría con mayor facilidad compuestos apolares en la muestra, como cadenas alifáticas o aromáticas. Por otro lado, un solvente polar como el agua o alcoholes, atraerán con mayor fuerza muestras polares, como ácidos o sales.

De igual forma, una fase estacionaria apolar, como el C₁₈ o C₈ , atraerá mayoritariamente compuestos apolares; y una Fase estacionaria polar, como la silica, atraerá mayoritariamente compuestos polares. La fase estacionaria Polar (silica) se le conoce como Fase Normal, debido a que fue la fase utilizada primeramente en los experimentos de Tswett; por otro lado, a la fase estacionaria apolar se le conoce como Fase reversa (o invertida).

Tabla 2. Características de la separación por polaridad.

Modo de separación	Fase estacionaria	Fase móvil
Fase normal	Polar	No – polar
Fase Reversa	No – polar	Polar

En este tipo de separación existen dos variables, la cromatografía con interacción hidrofílica (HILIC) y la cromatografía con interacción hidrofóbica (HIC).

En la técnica HILIC, basada en la cromatografía en fase normal, se utilizan cantidades pequeñas de agua (< 20%) en la fase móvil, de modo que sea posible arrastrar los compuestos que estén retenidos fuertemente a la fase estacionaria (Polar).

Por otro lado, la técnica HIC es un tipo de cromatografía de fase reversa, en la cual se utilizan fases estacionarias moderadamente hidrofóbicas (apolares), como la sílica unida a C₄, pero controlando el nivel de sales en la fase móvil polar. Este método es especial para compuestos biológicos, como proteínas, donde concentraciones altas de sal ayudan a retener la proteína en la fase estacionaria [salted out], sin des-naturalizarse; mientras que, a medida que se disminuye la concentración de las sales, las moléculas retenidas en la fase estacionaria comienzan a ser arrastradas por la fase móvil.

Las separaciones cromatográficas basadas en la carga eléctrica, llamadas cromatografía de intercambio iónico [IEC], tienen su base en utilizar fases móviles y estacionarias cargadas eléctricamente. Si la fase estacionaria está cargada positivamente [+], la técnica se llama intercambio Aniónico; si la fase estacionaria está cargada negativamente [-], la técnica se llama intercambio catiónico.

Esta técnica es un poco más compleja, ya que la liberación de los compuestos, a medida que se realiza el arrastre, tiene que ver con el control del pH de la fase móvil y el conocimiento previo del tipo de muestra analizada (ácido fuerte, ácido débil, base fuerte o base débil).

El último tipo de técnica utilizada es la cromatografía por exclusión de tamaño, la cual se realiza a través de una columna empacada con un polímero, cuya porosidad es muy uniforme y es aproximadamente conocida. Contrario a lo que podría pensarse, las moléculas más grandes son las primeras en salir de la columna, ya que no son retenidas entre las porosidades del polímero, de modo que es arrastrada más fácilmente por el solvente. Por otro lado, las moléculas más pequeñas son ocluidas dentro de los poros, y entran de un poro a otro, ocultándose del flujo del solvente. De este modo se cumple la regla: Los grandes salen primero.